@MartinZ_uncut - Martin Zizi

PCR (2) - Facile - C'est de la chimie simple 1. Voici une figure du site de Thermo-Fisher (un vendeur de machine PCR. https://thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-cycling-considerations.html Un cycle PCR a plusieurs étapes, et il y a TOUJOURS une amplification SPECIFIQUE de la séquence que l'on cherche et une amplification non-spécifique à très bas bruit. Car rien n'est jamais parfait à 100% en biomol. 2. On peut sur la figure en dessous [Image #1, à G] distinguer 3 phases. exponentielle, linéaire et le plateau. Le X2, X2, X2... c'est la phase EXPONENTIELLE, où il nous est facile de quantifier ce qu'on mesure dans l'échantillon initial (connu pour les standards de calibration et inconnu pour les tests). C'est la phase où les sondes SPECIFIQUES définissent les séquences pour lesquelles on va à la pêche, avec une grande fiabilité. La phase linéaire voit déjà qlq problèmes surgir... Quant au plateau - TOUT ce qui est amplifié a partir de ce moment n'a PLUS rien à voir avec les sondes spécifiques - it is just plain garbage! On peut donc dire - pour parler en termes d'ingénierie - que le rapport signal-bruit est optimal en phase exponentielle. Extrait de la doc: "Conversely, low cycle numbers are preferable for unbiased amplification (as in next-generation sequencing) and accurate replication of target DNA (as in cloning" 3. Les facteurs qui peuvent jouer sur ces amplification parasites? - Des séquences proches mais qui diffèrent de qlq bases, peuvent se comporter comme des contaminants. Cad d'autres virus, ou des débris d'ARN... - Température est un facteur important. Il faut savoir que si on a une sonde spécifique avec 12 bases (atgc etc...), si on a une légère différence de température (1-2 degrés), il y a des appariements non-spécifiques. Il suffit d'1 ou 2 bases non appariées pour pêcher un autre truc! - Un concentration en MgCl2. Ceci donne des erreurs de 'matching' des sondes avec leur cible, mais aussi des erreurs dans la réaction de PCR. [je crois qu'ils ont pas fait CETTE erreur, masi qui sait.. quand on fait des milliers de tests avec des centaines de gens, ce genre de trucs se passe...] C'est une méthode, couramment utilisée pour faire des mutations spontanées quand on étudie l'évolution darwinienne au niveau génétique (error-prone PCR mutagenesis - une des spécialités ds mon labo, Darwin!) Voir aussi ici: https://geneticeducation.co.in/pcr-troubleshooting-101-how-to-address-non-specific-amplification/#:~:text=In%20conclusion%2C%20non%2Dspecific%20amplification,MgCl2%20and%20low%20annealing%20temperature…. Et pour ceux qui sont plus techie/biol ici: Amplification of nonspecific products in quantitative polymerase chain reactions (qPCR). Ruiz-Villalba et al. https://ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5727009/ 4. Maintenant si nous revenons aux PCR en BE. 4a - Pour cloner un gène rare, on peut explorer et aller au delà de 30, 40 cycles.. car on cherche à voir... et si on obtient un mélange, on le voit sur les gels d'électrophorèse (ces images noires avec des bandes) et on peut toujours séparer les produits diffèrent, cad les EXTRAIRE du gel de séparation et no problème... - Pour détecter un signal, on ne fait pas du clonage, masi de la chimie ANALYTIQUE, donc pas le temps de contrôler CHAQUE résultat par des gels. - Comment faire en pratique? Donc si on SAIT que le seuil est de 1 million de virus par millilitre, on va centrer la calibartion autour de cette valeur. Et SURTOUT on va se débrouiller pour que ce seuil tombe en plein dans la ZONE EXPONENTIELLE donc FIABLE. 4b. C'est pour cela que l'on retombe sur des valeurs autour de 20 cycles (CT de 20). Si on a des CT vers 10, on a MILLE fois plus de virus (2 exp 10), ce qui possible avec une forte infection et contagiosité). Si on a des CT vers 25-26 on a 100 fois moins de virus donc on est SAFE, et NON malade. Vous voyez, viser une telle valeur est utile dans les 2 sens pour pouvoir DIRE quelque chose. 4c. ILS ONT FOIRÉ. et YVL ne pige aps garn chose aux PCR de manière évidente. Je vous met la figure BLOQUEE hier - le tableau des calibrations Belges [Image #2 à D]. Le seuil du million est en rouge. (relisez mon post d'hier et vous pouvez pleurer - on vous a pris pour des nazes!!! pdt plus d'un an) Donc quand on préconise de CT à 30, on foire Quand on ne calibre pas bien ses standards on foire etc... Le RAG (risk assessment group) en BE a émit des notes et conseils, mais sorry - elel revenaient à considérer que quqlquun qui avait entre 30 et virus par millilitres était un cas positif! CECI est d'une bêtise sans nom! 5. L'OMS, Drosten, ... TOUS ont raconté n'importe quoi pdt plus d'un an. Et ils sont prêts à recommencer Avec la variole du signe (monkeypox) , souvenez-vous ils ont tenté de refaire le coup des porteurs asymptomatiques. Ils ont diu laisser tomber. Souvenez-vous tous de ceci: SANS symptômes cliniques POSITIFS - PAS de PCR. C'est cela qui a fait que TOUTES les universités se sont tues - le fric (à coup de milliards) des PCR! C'est à cause de cela que la peur a pu être créée et surtout entretenue et que plein des gens qui ne devaient pas mourir sont morts! N'oubliez jamais svp. Vous comprenez mieux mtn mo challenge PUBLIC sur Kairos!

PCR Cycling Parameters—Six Key Considerations for Success | Thermo Fisher Scientific - US Learn about PCR cycling conditions and their considerations for successful results. thermofisher.com

@lacavernemythe - Médisa

@MartinZ_uncut @JeanYvesCAPO Pourriez vous développer ceci svp?